可以用NNk的一個混合物，也可以用Trimer引物構建基因文庫。

他設計是針對不同區域進行的一個設計，但是設計的條數是一樣的。SgRNA序列是不一樣的。抑制文庫是單質粒系統，激活文庫大部分都是雙質粒系統。

要先確定客戶是多基因還是單基因，還要確定設計幾條。如果說按照芯片設計價格是3000，也可以按照條數收費

Trimer引物合成的一個優勢，，可以根據客戶的物種進行一個設計。合成的方式效果也好，偏差更低。

一代測序，轉到細菌上進行一個擴大，挑選單克隆去看測序的結果是否是在我們設計的序列之內。

至少是200-300條，客戶全基因組范圍比較大的話會設計更多。

三保一套餐是我們為確保基因敲除成功而提供的一種服務。我們承諾，通過提供三條sgRNA選擇，確保至少有一條sgRNA能夠成功敲除目標基因，從而為客戶提供更大的成功率和保障。

我們采用的目的細胞是HepG2、Hela、293T細胞，如果有其他細胞要求，可以選擇定制化服務。

1. GC含量須在40%到80%之間，以確保sgRNA與目標DNA之間的穩定結合。

2. 確保sgRNA設計中的二級結構較少，如發夾結構和聚合酶終止序列。這些結構會影響克隆效率和向導的轉錄。

3. 去除polyA位點，如果以病毒作為遞送工具，這些位點會破壞病毒包裝。

4. 盡量減少錯配，特別是PAM上游的前10個堿基。間隔區序列的后半部分可容忍錯配，但靠近PAM位點的錯配會破壞結合和隨后的編輯。

5. sgRNA中的間隔區序列長度須與正在使用的Cas蛋白相匹配。兩者之間的不一致會嚴重減低編輯效率。

6. 研究并選擇最適合你需求的Cas蛋白。Cas蛋白在識別的PAM序列、切割類型及其他多個因素上存在差異，可能影響編輯性能。

7. 確保sgRNA啟動子的位置不與其他啟動子重疊，比如經常用于抗性基因轉錄的EF-1a啟動子。與該啟動子重疊會導致sgRNA的轉錄效率降低。

目前，市面上大多使用的是人基因組sgRNA文庫，利用基因組sgRNA文庫的篩選所得結果更為廣譜但實驗工程量大。而Syno^?人源通路文庫具有以下特點：

1、基因總數少，sgRNA文庫庫容小，減少實驗工程量及周期

2、Syno^?人源通路 sgRNA文庫使用目的性強，一般是在已知基因范圍內進行靶標篩選

3、可以選擇多個pathway同時進行研究

因此，使用Syno^?人源通路 sgRNA文庫前要清楚自己研究目的及通路基因，根據需求進行選擇單條通路或多條通路sgRNA文庫組合。

混合池是所有sgRNA質粒混合在一起，是默認的發貨形式，客戶可以直接用來轉染細胞或進行慢病毒包裝；陣列板式屬于特色定制化服務，根據客戶需求將每種sgRNA質粒置于單孔中，呈現陣列式分布以實現客戶對文庫的靈活運用。

以下是一些常用的在線設計sgRNA的網站以及它們的特點：

1.CRISPR Design Tools（https://www.benchling.com/crispr/）：Benchling是基于目標序列的算法來設計sgRNA，考慮了靶向性、特異性和副作用等因素。

2.CRISPOR（http://crispor.tefor.net/）：CRISPO使用最為廣泛，是基于基因組的算法來設計sgRNA，考慮了靶向性、特異性和副作用等因素，并提供了對設計結果的詳細分析。

3.CHOPCHOP（https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/）：CHOPCHOP提供了一個用戶友好的界面，使用了基于基因組的算法來設計sgRNA，也會考慮靶向性、特異性和效率等因素。

4.CRISPRscan（https://www.crisprscan.org/）：使用了基于機器學習的算法來預測sgRNA的效率，并提供了對設計結果的可視化分析。