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載體指南

泓迅生物精心編制的載體指南，不僅內容詳盡，而且結構清晰，旨在為科研工作者提供一個便捷的參考工具。在載體指南中，我們詳細介紹多種類型的載體，包括但不限于質粒載體、病毒載體、克隆載體、表達載體等。我們針對每一種載體都進行詳盡的闡述，包括其特點、優勢、限制、應用等關鍵信息。

泓迅生物的載體指南是一份寶貴的學習資料，它將為您在科研道路上提供有力的支持和幫助。我們期待與您攜手共進，共同推動生物技術的發展和創新。

一、載體概述

載體

將目的基因（DNA片段）轉入目標細胞、組織或生物體中以實現基因克隆、表達、編輯等一系列功能研究，該方法是生物領域最常用的一種研究方法。在基因工程領域，為避免目的基因DNA片段序列的降解同時保證功能有效性，在轉入細胞、組織或生物體之前，需要先通過基因工程技術將目的基因構建在一類具有在宿主細胞內進行自主復制能力的DNA分子上，該類運輸工具被稱為載體（Vector）。其中，工程化的質粒是基因工程中最常用的載體。

質粒載體

質粒是生物細胞內固有的、能獨立于寄主染色體而自主復制、并被穩定遺傳的一類核酸分子，常見于原核細菌及真菌中。絕大多數的質粒是DNA型的，少部分為RNA型。天然DNA質粒大都具有共價、封閉、環狀的分子結構，具有分子量大、拷貝數低、單一酶切位點少等特點。通過對天然質粒進行元件添加、優化等工程化改造，將其轉換成基因工程中最常用的載體，也稱為質粒載體。

功能特點：

　　? 載裝能力：具有外源基因插入位點，外源基因插入該位點后不會破壞質粒載體的功能。
　　? 運輸能力：將目標基因轉入細胞。
　　? 復制或整合能力：為目標基因提供復制能力或整合能力。
　　? 具有擴增或表達能力：為目標基因的擴增或表達提供必要條件。
　　? 具有篩選標記。
　　? 具有不相容性：含有相同Ori的2個不同的質粒不能同時存在于1個細胞中。

基本組成元件：

　　（1）復制起始點（Ori）：一段富含AT和重復序列的特定序列，通過招募復制相關蛋白啟動質粒復制。Ori決定了質粒在宿主中的拷貝數，高拷貝質粒（10-60個拷貝）被稱為松弛型復制質粒；低拷貝質粒（1-3個拷貝）被稱為嚴緊型復制質粒，通常適用于毒性基因及大片段基因的克隆。只有1個Ori，表示是原核的克隆或表達質粒；有2個Ori，則表示該質粒是穿梭質粒，即可在原核也可在真核中復制。注意：具有相同的ori的質粒具有不相容性，不可共轉染。
　　（2）抗性篩選基因（R）：即抗生素抗性基因，方便后續通過抗生素篩選陽性克隆。一般克隆發載體只有1種抗性篩選標記，部分穿梭質粒具有2種抗性篩選標記。注意：原核生物和真核生物中的篩選基因不完全一致，原核生物中常見的有Ampr、Camr、Kanr、Tetr等；真核生物中常見的有Puro、G418、Hygr；原核和真核都可以的篩選基因有Zeocin、Blasticidin。
　　（3）多克隆位點（MCS）：即多個限制性內切酶酶切位點匯集序列區，其中的每個酶切位點在整個質粒載體中只有一個。MCS區是外源基因的插入位點，一般位于啟動子與轉錄終止信號元件之間。不同載體，MCS所包含的限制性內切酶種類、數目不同。注意：插入基因序列過長會導致質粒載體轉化效率變低。
　　（4）啟動子（P）：通過與RNApol特異型結合，啟動下游DNA轉錄的一段DNA序列，本身不被轉錄。啟動子決定基因表達的細胞類型及表達量。根據在細胞中啟動表達的形式不同，分為3類：組成型/廣譜型啟動子，組織/細胞基因特異性啟動子，誘導表達啟動子。
　　（5）增強子（Enhancer）：一種增強鄰近基因轉錄過程的順式作用元件，無方向性。
　　（6）核糖體識別位點（RBS）：位于mRNA的起始密碼子（AUG）上游，核糖體可以識別、結合這段序列并向下尋找ATG以起始蛋白翻譯。在原核生物中表達載體上的RBS為SD序列(位于AUG前面）；在真核生物中，主要依賴于mRNA的5’端帽子結構，除此之外，IRES元件和2A多肽元件也可作為RBS以啟動蛋白表達。
　　（7）轉錄終止子（Terminator）：位于待轉錄基因下游的3’端調控元件之后，主要為多聚腺苷酸化或聚（A）信號，具有終止轉錄功能。原核生物主要為polyA；真核生物如哺乳動物常見的終止子（SV40 polyA、hGH polyA、BGH polyA和rbGlob）包括促進聚腺苷酸化和終止的序列基序AAUAAA。

　　（8）引物結合位點（PBS）：一段短的單鏈DNA序列，可以與PCR擴增或測序的引物結合，主要用于質粒序列的人工檢測。注意：該類位點可以根據應用進行靈活設計。

二、質粒載體分類

質粒載體將目的基因導入宿主細胞，進而實現基因功能表達，這些載體在分子生物學研究中發揮著至關重要的作用，是推動合成生物學、生物醫藥、基因治療、靶點藥物篩選及農業生物技術等領域發展的基礎。根據質粒載體的多樣化應用，其分類也是多樣化的，主要有以下幾種：

1、按照屬性質粒載體可分為：病毒載體和非病毒載體。其中，病毒載體是一種利用病毒作為基因傳遞的載體，通常通過將外源基因插入或替換病毒基因組的方式，將所需的基因輸送至目標細胞中。病毒載體具有高度傳染性和特異性，能夠在宿主細胞中高效地傳遞和表達外源基因。

病毒載體的應用：

　　（1）基因治療：利用病毒載體將治療性基因導入到目標細胞中，用于治療遺傳性疾病、癌癥等疾病。
　　（2）基因編輯：利用病毒載體將基因編輯工具（如CRISPR/Cas9系統）輸送至目標細胞中，實現基因組的精準編輯和修飾。
　　（3）疫苗開發：利用病毒載體作為疫苗遞送平臺，輸送目標抗原基因至免疫細胞中，誘導免疫反應，從而產生保護性免疫應答。
　　（4）基因研究：在基因功能研究、蛋白質表達和藥物篩選等領域，病毒載體用于將特定基因傳遞到細胞或動物模型中，研究其功能和作用機制。

病毒載體分類及比較如下：

載體類型	定義	特點	優勢	限制
慢病毒（LV）載體	一種基于慢病毒（如人類免疫缺陷病毒HIV-1）的基因傳遞系統，去除了病毒的復制和致病基因，慢病毒載體保留了病毒將遺傳物質整合到宿主細胞的基因組中特性。	1、整合能力：可將外源基因整合進宿主細胞的染色體DNA中。 2、宿主范圍廣：對分裂細胞和非分裂細胞都有感染能力。 3、可穩定性表達。	載荷容量較大：適用于攜帶較大基因片段或多個基因的轉導。	潛在致癌風險：基因整合可能導致插入突變，增加致癌風險。
腺病毒載體	一種基于腺病毒（Adenovirus）的基因轉移工具，腺病毒是一種無包膜的雙鏈DNA病毒，能夠在非分裂的細胞中高效地表達外源基因，不整合到宿主細胞基因組中，適合短期表達。	1、非整合能力。 2、感染范圍廣：能夠感染包括分裂細胞和非分裂細胞在內的廣泛宿主細胞。 3、瞬時表達。	1、高效感染：能夠在短時間內感染大量細胞。 2、安全性高：腺病毒載體不整合到宿主細胞染色體中，無插入致突變性。 3、高滴度：腺病毒載體可產生高滴度的病毒液，有利于大規模制備和應用。	1、瞬時表達：外源基因表達持續時間較短，需要多次接種以達到治療效果。 2、免疫反應風險：腺病毒具有較強的免疫原性，可能引發宿主細胞的免疫反應和炎癥反應，影響治療效果。
腺相關病毒（AAV）載體	一種基于腺相關病毒（Adeno-Associated Virus, AAV）的基因轉移工具，AAV是一種小的、非包膜的單鏈DNA病毒，它與多種腺病毒有關，但與腺病毒不同，AAV本身不會引起疾病，因此在作為基因載體時具有很高的安全性。	1、小型單鏈DNA病毒：基因組DNA＜5 kb，無包膜。 2、非致病性：AAV自然存在于人類中，但并不會導致任何已知的疾病。	1、安全性高：AAV不會破壞宿主細胞的基因組，不會引起明顯的免疫反應或病理反應。 2、可長期表達：AAV可以在宿主細胞中長期表達外源基因。 3、靶向性：AAV有多種血清型，不同的AAV血清型可以靶向不同的細胞和組織。	1、載體容量有限：AAV的基因組較小，能夠攜帶的外源基因序列長度有限，通常不超過4.5 kb。 2、免疫原性：雖然AAV的免疫原性較低，但在部分人群中仍可能引起免疫反應。 3、制備成本高：AAV的制備過程較為復雜，成本較高。
逆轉錄病毒載體	一種利用逆轉錄病毒作為遞送系統的基因轉移工具，逆轉錄病毒載體通常來源于能夠將RNA逆轉錄成DNA的病毒，如人類免疫缺陷病毒（HIV）經過改造后的形式。	1、RNA病毒：逆轉錄病毒是一種單鏈RNA病毒，其基因組以RNA形式存在。 2、逆轉錄機制：逆轉錄病毒利用逆轉錄酶將其RNA基因組逆轉錄為DNA，并整合到宿主細胞基因組中。	1、穩定表達：由于整合到宿主基因組，逆轉錄病毒載體可以實現長期的基因表達。 2、較大基因載量：逆轉錄病毒能夠攜帶較大的外源基因序列，通常可達8-10 kb。 3、感染效率高：逆轉錄病毒載體可以感染多種類型的細胞，包括一些難以轉染的細胞類型。 4、技術成熟：逆轉錄病毒載體技術相對成熟，有多種載體和包裝系統可供選擇。	1、整合位點不確定性：逆轉錄病毒隨機整合到宿主基因組中，可能引起插入突變，導致基因組不穩定性和潛在的致癌風險。 2、主要感染分裂細胞。 3、潛在的免疫反應：盡管逆轉錄病毒通常不會引起強烈的免疫反應，但在某些情況下仍可能引發宿主免疫系統的反應。

2、按照進入受體細胞的類型不同可分為原核載體、真核載體和穿梭載體（即可以存在于原核細胞，又可存在于真核細胞）。

3、按照Ori元件不同可分為高拷貝質粒和低拷貝質粒。

4、按照載體性質不同可分為融合型載體和非融合型載體。融合型載體能夠將外源基因整合進宿主細胞的基因組實現外源基因在宿主細胞中的穩定表達，又稱為穩定型表達載體；非融合型載體裝載著目標基因以游離的形式存在于細胞中，使得目標基因在宿主細胞中的短暫表達，又稱為瞬時表達載體。

瞬時表達載體與穩定性表達載體比較如下：

質粒類型	工作原理	導入細胞方法	特點	優勢	限制	應用
瞬時表達載體	游離于細胞中，帶動目標基因在短時間內快速表達并達到高峰，隨后逐漸降低。	病毒包裝、化學試劑、電穿孔等。	篩選標記基因是非必須元件；表達快速、操作簡單。	表達快速、操作簡單、靈活、成本低	1、可能觸發細胞防御機制，導致基因沉默； 2、高效表達可能會對細胞產生毒性； 3、表達非永久且不穩定。	快速分析基因的功能或蛋白活性。
穩定表達載體	將目標基因整合在宿主細胞基因組后使得目標基因持續且穩定性表達。	病毒包裝、化學試劑、電穿孔等	篩選標記基因是必須元件；持續穩定表達	長期穩定表達、表達水平可控、遺傳穩定性、安全性高、可重復性好	1、轉化效率低； 2、細胞篩選周期長、成本高； 3、轉染/轉化條件苛刻	在基因工程、細胞生物學及醫學等領域應用廣泛，如重組蛋白生產、基因功能研究、基因治療藥物開發等。

5、按照功能不同可分為克隆載體、表達載體、基因編輯載體、表達調控載體、體外轉錄載體及功能檢測載體等。

? 克隆載體查看詳細

? 表達載體查看詳細

主要元件組成：除了克隆載體的基本元件，還須具備轉錄/翻譯所必須的DNA元件，如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止信號。啟動子驅動目標基因轉錄生成RNA，合成的RNA在轉錄終止信號下停止轉錄。

（1）根據啟動子類型可分為組成型表達載體、組織特異性表達載體和誘導表達載體，比較如下：

載體類型	特點	優勢	限制	應用
組成型表達載體	能在多種細胞類型或生物體中實現基因的持續表達。	表達量高；構建及使用較為簡單；通用性：不受細胞類型限制	缺乏調控性：基因過表達可能對細胞產生毒性；持續表達，消耗過量細胞資源，影響細胞的正常生理功能。	通過基因亞細胞定位及過表達研究基因功能；提高基因表達量以獲得大量目標蛋白
組織特異性表達載體	在特定的細胞類型、發育階段或環境條件下，對目標基因進行選擇性表達。	特異性表達：能夠在特定的細胞類型、組織類型下實現外源基因的特異性表達，而不影響其他細胞或組織。特定調控元件：如組織特異性啟動子、調節子或響應元件等，用于調控外源基因的表達。	復雜性：需要設計和構建特異性調控元件，相對比較復雜，需要一定的技術和資源支持。表達水平波動：外源基因的表達水平可能不夠穩定，需要進一步優化調控元件以提高表達的穩定性。	適用于多種研究或應用領域，如基因治療、基因調控、生物傳感等。
誘導表達載體	含有特定的誘導或響應元件，在特定的外部信號或誘導劑的作用下，對目標基因進行調控性表達。	精確調控：可精確控制基因表達的時間和強度，有助于避免非特異性效應。節省成本：只在必要時誘導表達，避免了持續表達可能造成的資源浪費。靈活性高：能夠根據需要選擇不同的誘導條件，實現外源基因的誘導表達或抑制。	操作復雜：需要精確控制誘導劑的添加時間和濃度，以及可能需要考慮誘導劑對細胞的影響。誘導條件限制：誘導型表達載體的誘導表達通常受到特定條件的限制，可能不適用于所有研究或應用場景。表達水平波動：不同實驗條件下，表達水平可能存在波動，需要精細調控。	適用于特定條件下基因功能研究及蛋白的表達。

（2）根據啟動子來源可分為哺乳動物表達載體、酵母表達載體、大腸桿菌表達載體等。

（3）根據目標基因類型可分為常規基因表達載體、重組蛋白表達載體、非編碼RNA表達載體、抗體蛋白表達載體等。

常規基因表達載體、重組蛋白表達載體、非編碼RNA表達載體及抗體蛋白表達載體比較如下：

載體類型	目標基因	特點	限制	應用
常規基因表達載體	未知功能的基因或特定序列	具有篩選marker或報告基因元件：通過篩選marker或報告基因實現基因的亞細胞定位或實現基因過表達或恢復表達。	免疫原性：部分表達載體會使宿主細胞產生免疫反應，導致載體被清除或細胞死亡。	基因的功能研究
重組蛋白表達載體	編碼目標蛋白的基因序列	根據目標蛋白設計出的基因序列，不一定是天然存在的；含有目標蛋白篩選、純化的特定標簽元件；具有多樣化的蛋白表達系統如大腸桿菌、酵母、哺乳動物、昆蟲細胞等。啟動子多為誘導型表達啟動子；具有良好的擴展性：從實驗級別到工業級別。	1、成本高:從載體構建到蛋白純化。 2、放大困難：主要受困于細胞生長條件、產物穩定性維持等。 3、部分蛋白因結構復雜、難以正確折疊或易被宿主細胞降解等原因而無法高效表達。
非編碼RNA表達載體	miRNA、siRNA、lncRNA或circRNA等多種類型	特異性：針對特定的基因或RNA分子進行RNA序列選擇及設計。	1、引發免疫反應； 2、出現非特異性調控； 3、穩定性差：非編碼RNA 在體內的穩定性較低	1、調控基因表達； 2、可作為研究非編碼RNA生物學功能的有利工具； 3、具有治療某些由異常基因表達引起的疾病
抗體蛋白表達載體	編碼特定抗體的基因序列，包含編碼抗體重鏈和輕鏈的DNA片段	靈活性強:可表達多種類型的抗體，包括單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體等。通過改造和優化載體，還可以實現多基因共表達、融合蛋白表達等高級應用。	1、表達效率的不穩定性：載體表達效率受到宿主細胞類型、培養條件、基因序列等因素導致表達效率的不穩定。 2、活性不易控制：抗體聚集和錯誤折疊而失去活性。 3、純化成本高：昂貴的純化試劑和設備，增加了抗體生產的成本。 4、宿主細胞的安全性：某些宿主細胞（如哺乳動物細胞）進行抗體表達時，可能攜帶病毒、細菌或其他病原體，需要嚴格的生物安全措施來確保生產過程中的安全。	抗體藥物研發

主要功能與應用：

（1）基因表達與功能研究：在特定宿主細胞中表達目標基因，并研究該基因在宿主細胞中的功能。這種技術對于理解基因在生物體內的作用機制、基因功能發現等具有重要意義。

（2）蛋白生產：用于生產具有特定功能的蛋白質。通過選擇適當的宿主細胞和表達載體，可以高效地表達并純化目標蛋白，用于生物制藥、診斷試劑、工業酶等領域。

（3）基因療法：在基因治療領域，表達載體可將正常的基因導入到患者的細胞中，以替換或修復缺陷基因。通過這種表達載體介導的基因轉移技術，可以實現基因在患者細胞中的長期、穩定表達，從而達到治療疾病的目的。

（4）疫苗開發：表達載體將抗原基因導入特定宿主細胞中表達，誘發免疫反應可以制備出具有免疫原性的抗原蛋白。這些抗原蛋白可以用于制備疫苗，預防和控制傳染病的發生。

? 編輯載體查看詳細

編輯載體（Editing Vector）是一種用于基因編輯的分子工具，它通常基于質粒（plasmid）或其他DNA載體系統，并攜帶特定的基因編輯元件，如DNA核酸酶、識別序列以及模板DNA等，用于在目標生物體的基因組中進行精確的DNA序列修改。編輯載體的設計和構建需要高度的專業知識和技能，以確保編輯的精確性和效率。隨著基因編輯技術的不斷發展，編輯載體在生物醫學研究、農業生物技術、基因治療等領域的應用前景越來越廣闊。

主要功能與應用：

（1）基因敲除：通過DNA核酸酶在特定位置切割DNA，然后依賴細胞的DNA修復機制（如非同源末端連接）來刪除或破壞基因。

（2）基因敲入：在DNA切割后，通過提供模板DNA來引導細胞進行同源重組，從而在特定位置插入新的DNA序列。

（3）基因修復：類似于基因敲入，但用于修復已存在的突變或缺陷。

根據編輯對象不同，主要分為CRISPR Cas9敲除載體和CRISPR Cas13敲除載體，比較如下表：

載體類型	定義	特點	編輯對象	限制
CRISPR Cas9敲除載體	一種基于CRISPR-Cas9系統的基因敲除（Knockout，Ko）工具。載體上的Cas9蛋白來源于化膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的II型CRISPR/Cas系統，能夠精確地識別和切割目標DNA序列，實現基因的定點敲除。	1、靈活性：載體構建技術易于操作，可以通過改變Cas9蛋白的序列實現對不同DNA序列的剪切。 2、廣泛適用性：載體構建技術可廣泛應用于各種生物體系，包括細菌、酵母、植物、動物等。	DNA	1、脫靶效應：存在一定的脫靶效應。 2、基因組不穩定性：引起的DNA斷裂和修復可能導致基因組的不穩定性，增加突變的風險。 3、致癌風險：研究表明，CRISPR Cas9-Ko載體可能引發某些類型的癌癥。
CRISPR Cas13敲除載體	Cas13是一種能夠切割RNA的CRISPR相關蛋白，具有高度的RNA識別和切割能力，能夠精確地識別和切割目標RNA序列。	1、靈活性：Cas13-Ko載體可以靈活地針對不同的RNA序列進行編輯，只需要更換相應的crRNA即可。 2、安全性：Cas13-Ko載體在RNA水平下進行編輯，不會改變基因組DNA序列，因此避免了可能由DNA編輯引起的脫靶效應和基因突變等風險。此外，Cas13-Ko載體在編輯過程中產生的副產物較少，對細胞毒性較低，進一步提高了其安全性。	RNA	1、脫靶效應：盡管CRISPR Cas13在RNA識別方面具有較高的特異性，但仍存在一定的脫靶效應風險。 2、長期效果和安全性：CRISPR Cas13-Ko載體在RNA編輯方面的長期效果和安全性仍需要進一步研究和評估。

? 表達調控載體查看詳細

表達調控載體通常包含啟動子、增強子、沉默子等必須的順式調控元件，以及一個或多個用于插入目標基因的多克隆位點。通過設計這些調控元件，研究人員可以精確地控制目標基因在特定時間、特定組織或特定條件下的表達水平。

主要功能與應用：

（1）基礎科學研究：通過構建表達調控載體，可以精確地控制目標基因在特定時間或特定細胞類型中的表達，從而深入研究該基因在生物體中的功能。

（2）代謝工程：通過精確控制關鍵酶的表達水平，提高目標產物的產量或改變其代謝產物的比例。

（3）醫藥研發：通過調控治療基因的表達來糾正或補償缺陷基因的功能，實現疾病的基因治療。

（4）作物改良：通過提高抗旱、抗病或抗蟲基因的表達水平，增強作物的抗逆性。

　根據調控表達形式主要分為CRISPRi載體及CRISPRa載體。詳情如下表：

載體類型	特點	關鍵元件	工作原理
CRISPRi載體	用CRISPR/Cas系統從阻止基因轉錄的起始來抑制或沉默特定基因的表達； CRISPRi介導的敲低是可誘導且可逆的。	dCas9、sgRNA、KRAB	主要依賴于dCas9（沒有切割活性的Cas9）和sgRNA（單鏈引導RNA）的復合物。當這個復合物被引導到靶基因的轉錄起始位點（TSS）時，dCas9能夠物理性地阻礙RNA聚合酶的通過，導致基因沉默。同時，dCas9可以融合一個基因抑制結構域，如KRAB結構域，進一步提高轉錄抑制的效率。這種結構域可以阻止轉錄因子與DNA的結合，從而抑制基因的表達。
CRISPRa載體	利用CRISPR/Cas9系統原理進行基因激活表達；	dCas9、sgRNA、轉錄激活結構域（如VP64或p65AD）	將dCas9與轉錄激活結構域（如VP64或p65AD）融合，形成一個具有轉錄激活功能的Cas9-激活域融合蛋白。當這個融合蛋白與sgRNA結合時，它可以被引導到目標基因的啟動子或增強子區段，并通過轉錄激活結構域的作用，促進RNA聚合酶的招募和轉錄起始復合物的形成，從而實現對目標基因的激活。